Gen düzenleme nihayet Nobel Kimya Ödülü'nü bekliyor! İki kadın bilim adamı yakaladı, neden Zhang Feng olmasın?
Yazar | Parka Dön
7 Ekim akşamı, Pekin saatinde, 2020 Nobel Kimya Ödülü, gen düzenlemesine yaptıkları katkılardan dolayı Emmanuelle Charpentier ve Jennifer A. Doudna'ya verildi.
Kazananlara giriş:
Fransız mikrobiyolog Dr. Emmanuelle Charpentier şu anda Almanya'daki Max Planck Enstitüsü'nde Enfeksiyon Biyolojisi Enstitüsü'nün direktörüdür. CRISPR'nin geliştirilmesinde ana katkısı, Cas9 proteininin aktivitesinin tracrRNA'ya bağlı olduğunu bulmaktır.
Jennifer A. Doudna Berkeley Üniversitesi'nde kimya ve moleküler biyoloji ve hücre biyolojisi profesörü, Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nde araştırmacı ve Ulusal Bilimler Akademisi üyesidir. O ve Dr. Emmanuelle Charpentier, Cas9'un bölünme etkisini ve crRNA'nın konumlandırma etkisini ortaklaşa keşfettiler ve crRNA ve tracrRNA'yı tek sarmallı kılavuz RNA'ya (sgRNA) kaynaştırdılar.
İlgili alanlardaki uzmanlar, Çinli bilim adamı Zhang Feng'in, ökaryotik hücrelerde gen düzenlemesi yapmak için CRISPR-Cas9'u ilk kez kullandığını, ancak ödülü kazanmayı başaramadığını analiz etti. Bunun nedeni, Zhang Feng'in çalışmalarının daha az orijinal olması ve katkılarının orijinal hücrelere daha çok benzemesi olabilir. Cohen ve Boyer'in yeniden yapılanmadaki katkıları (1980 Kimya Ödülü, yapay yeniden yapılanma ile Berg'e verildi) ve Kimya Ödülü, in vitro deneylerin sonuçlarına daha fazla önem veriyor ve atılımları esas olarak hücreye yansıyor.
CRISPR artık biyotıpta çok popüler bir gen düzenleme teknolojisidir.Son yıllarda bu teknolojinin hızlı gelişimi popüler hale getirilmiş ve biyoloji, tıp, tarım ve çevre gibi birçok alanda uygulanmış, özellikle de bilimsel mucizeler yaratmıştır. Genetik hastalıkların tedavisi, hastalıkla ilgili genlerin taranması ve tespiti, tümör tedavisi, hayvanların ve bitkilerin dönüşümü ve patojen mikroorganizmaların önlenmesi ve tedavisi büyük bir potansiyele sahiptir ve tüm dünya üzerinde derin bir etkiye sahip olacaktır.
1. CRISPR nedir
CRISPR'nin tam adı, Çince'de "düzenli olarak kümelenmiş kısa Palindromik Tekrarlar" anlamına gelen Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar'dır. Bu kelimenin gerçek anlamı, "bariz özelliklere sahip, düzgün bir şekilde düzenlenmiş ve tutarlı bir sırayla aynı tür tekrarlayan diziyi temsil etmektir". Bakterilerin uyarlanabilir bağışıklık sistemi olarak hizmet eder.Yabancı virüs veya plazmid DNA hücreye girdiğinde, özel Cas proteini yabancı DNA'yı küçük parçalara böler ve bunları depolanmak üzere kendi DNA fragmanlarına yapıştırır. Tekrar bir virüs istilası ile karşılaştığında, bakteri virüsü depolanan parçalara göre tanıyabilir ve virüsün DNA'sını keserek geçersiz kılabilir. .
Bilim adamları, CRISPR'nin bu işlevini, onu devrim niteliğinde yeni bir moleküler araca dönüştürmek için kullanıyor. Her türlü genetik materyali doğru bir şekilde bulma ve kesme yeteneğine sahip olduğu için, bilim adamlarının yeryüzündeki herhangi bir canlının (insanlar dahil) yaşam kodunu kırmasını kolaylaştırır.
2. CRISPR'nin kısa bir geçmişi
Şekil 1: CRISPR geliştirmenin kısa bir geçmişi
CRISPR'nin keşfi ve adlandırılması
1987 gibi erken bir tarihte, Japonya'daki Osaka Üniversitesi'nin Nakata araştırma grubu, E. coli'yi analiz ederken bakterilerde bazı anormal şekilde tekrarlanan diziler olduğunu keşfetti. . Ancak o zamanlar insanlar bu tekrar eden dizilerin tam olarak ne olduğunu bilmiyorlardı ve resmen isimlerini bile vermemişlerdi. İspanya'daki Alicante Üniversitesi'nden Francisco Mojica, 1980'lerin sonuna kadar, bir arkeolojik türde benzer bir tekrarlayan diziyi bir kez daha buldu. , Bu da onun büyük ilgisini uyandırdı. Daha sonraki araştırmalarında, mikroorganizmalarda benzer yapılar arıyordu.2000 yılına kadar bu benzer diziyi 20'den fazla farklı mikroorganizma türünde bulmuştu. . 2002 yılında, Hollanda'daki Utrecht Üniversitesi'nden Ruud Jansen, farklı türlerin tekrarlayan dizilerindeki bazların sayısında büyük farklılıklar olduğunu keşfetti ve bu dizi yalnızca prokaryotlarda var. İlgili araştırmaları daha iyi düzenlemek için, bu tekrarlayan diziyi ortaklaşa "CRISPR" olarak adlandırdılar. . CRISPR ile ilgili birkaç gen Cas (CRISPR ile ilişkili) ailesi olarak adlandırılır. .
CRISPR-CAS sisteminin biyolojik rolü
2005 yılında, CRISPR araştırması önemli bir keşfi başlattı.Her iki araştırma grubu (Mojica ve Pourcel), CRISPR tekrarları arasındaki boşluk dizisinin prokaryotlardan değil, plazmidlerden veya virüslerden geldiğini gözlemledi. . Bu nedenle Mojica, CRISPR'nin uyarlanabilir bir bağışıklık sistemi olduğu hipotezini öne sürdü. Aynı yıl, Bolotin ekibi Streptococcus thermophilus'ta Cas9'u keşfetti ve bu devasa proteinin nükleaz aktivitesine sahip olduğunu tahmin etti. Ayrıca, virüse benzer aralayıcı dizilerin hepsinin, hedef dizilerin tanınması için gerekli olan PAM (protospacer bitişik motif) dizileri olarak adlandırılan benzer bir kuyruğa sahip olduğunu buldular.
Bu hipotezden hareketle, o sırada hala ünlü yoğurt şirketi Danisco'da çalışan Fransız mikrobiyolog Rodolphe Barragou, faj enfeksiyonunun neden olduğu ve yoğurt üretimini etkileyen Streptococcus thermophilus ölümü sorununu çözmek için bunu doğrulamaya karar verdi. 2007'de, deneylerle CRISPR sisteminin gerçekten uyarlanabilir bir bağışıklık sistemi olduğunu kanıtladılar. Bir virüs tarafından istila edildikten sonra, Streptococcus thermophilus, faj genomundan yeni bir aralayıcı sekansı entegre eder.Aynı virüs tekrar istila ettiğinde, bakteriler saldırıya direnme yeteneğine sahip olacaktır. Cas9 proteini bu bağışıklık için gerekli olabilir. Bu, CRISPR-Cas'ın bakteriyel olarak edinilmiş bir bağışıklık sistemi olduğuna dair ilk deneysel doğrulama.
CRISPR-CAS'ın etki mekanizmasının doğrulanması
CRISPR-CAS'ın biyolojik işlevinin doğrulanması, birçok araştırma ekibinin bu sistemin önemini fark etmesini sağladı ve ardından birçok araştırma ekibi, CRISPR-Cas sisteminin fajlarla etkileşim mekanizmasının ayrıntılarını tamamlamaya başladı. 2008'de John van der Oost'un araştırma ekibi, Escherichia coli'de fajdan gelen aralayıcı dizinin CRISPR RNA (crRNA) adı verilen küçük RNA'ya kopyalandığını keşfetti ve Cas proteinini hedef DNA'ya yönlendirdi. Marraffini ve Sontheimer, aynı yıl CRISPR-Cas sisteminin hedef molekülünün RNA değil DNA olduğunu kanıtladı. Sistem bakteriyel olmayan bir sisteme aktarılırsa, güçlü bir alet sistemi haline gelebileceğini de açıkça belirttiler. . Bu, sonraki gen düzenlemesinin yolunu açtı.
Aralık 2010'da, Moineau ekibi, CRISRP-Cas9'un PAM dizisinin yukarı akışındaki hassas bölünmesinin DNA çift sarmallı kırılmalara neden olduğunu kanıtladı. Tip II CRISPR sisteminin önemli bir özelliği olan Cas9, kesim için gereken tek proteindir ve CRISPR-Cas9'un crRNA'larla birlikte girişim işlevine aracılık eder. .
2011'de Charpentier'in araştırma ekibi, Streptococcus pyogenes üzerinde küçük RNA dizilimi gerçekleştirdi ve crRNA'ya ek olarak, tip aktive CRISPR RNA (tracrRNA) adı verilen küçük bir RNA da olduğunu buldu. tracrRNA, CrRNA'da tekrarlayan dizilerle 24 nükleotidin tamamlayıcı eşleşmesi ve bir çift iplik oluşturması yoluyla Cas9'u hedef DNA'ya yönlendirir. Bu noktada, doğal CRISPR-Cas9 girişim mekanizması bulmacası temelde tamamlandı .
CRISPR-CAS gen düzenleme teknolojisinin ortaya çıkışı
2012'de Charpentier ve Doudna ekibi işbirliği yaptı, sadece Cas9'un DNA'yı çift sarmallı kesme yeteneğine sahip olduğunu kanıtlamakla kalmadı, aynı zamanda tracrRNA ve crRNA'yı sgRNA'ya (tek kılavuz RNA) bağlayabildiğini kanıtladı ve in vitro deneyler, sgRNA'nın Cas9 proteinini DNA'yı tamamlamak için yönlendirebileceğini doğruladı Çift sarmallı kesme. CrRNA'nın sırasını değiştirerek Cas9'un hedefleme sitesini kontrol edebilirler. . Siksnys ekibi daha sonra aynı bulguları bildirdi. Bu keşif, sadece bakteriyel edinilmiş bağışıklık sistemi alanında bir kilometre taşı değil, aynı zamanda CRISPR-CAS gen düzenleme teknolojisinde yeni bir sayfa açtı. Yakında, 2013'ün başlarında birçok makale CRISPR-Cas sistemini memeli hücrelerine başarıyla uyguladı. Bunlar arasında, Church araştırma grubu, insan 293T hücrelerinde, K562 hücrelerinde ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerde sgRNA tasarlayarak spesifik dizileri başarıyla hedefleyen bir tip II CRISPR-Cas sistemi tasarladı ve birden fazla gRNA, hedef genlerin birden fazla düzenlenmesini sağlayabilir. . Zhang Fengin laboratuvarı, CRISPR-Cas9 sisteminin insan ve fare hücrelerinde bölgeye özgü hassas bölünme gerçekleştirebildiğini ve Cas9'u homoloji onarım sürecini desteklemek için bir boşluk enzimine dönüştürdüğünü kanıtladı. . Qi araştırma grubu, CRISPRi sistemini kurdu ve birden çok geni (Tet1, Tet2, Tet3, Sry ve Uty) hedefleyen birden çok sgRNA'nın aynı anda bölgeye yönelik mutagenezini gerçekleştirdi. . Wu ve arkadaşları, CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak, sağlıklı yavrular elde etmek için baskın Crygc mutasyonları olan farelerde gen terapisi gerçekleştirmek için kullandı ve genetik hastalıkların gen terapisi için CRISPR-Cas9 sistemi için bir temel oluşturdu. .
Sonuç olarak, CRISPR sisteminin çeşitli biyolojik gen yönlendirmeli düzenleme, genom tarama, gen transkripsiyon düzenleme, gen kompozisyon görüntüleme, gen tanı ve tedavisi, ekolojik uygulamalar ve diğer alanlardaki araştırma ve uygulaması patlamaya başladı. Sonraki yıllarda, Zhang Feng'in laboratuvarı CRISPR-CAS gen düzenleme sistemini genişletti ve yalnızca belirli ve çok genli düzenlemede büyük avantajları olan CRISPR-Cas sistemini keşfetmedi: CRISPR-Cpf1 , RNaz fonksiyonlu CRISPR enzimi Cas13a (C2c2) de bulundu Ve Cas13b . 2017'de, CRISPR-Cas13 sisteminin mekanizmasını, klinik teşhiste uygulamasını ve memeli hücrelerinde RNA'yı hedefleme yeteneğini inceleyen birçok makale vardı.
3. CRISPR gen düzenleme teknolojisinin uygulanması
CRISPR teknolojisinin hızlı gelişimi, translasyonel tıp ve hastalık tedavisi uygulamalarında sürekli olarak sürprizler yarattı. Science, 2015 yılında genetik hastalıkların hayvan modellerini tedavi etmek için CRISPR'yi başarıyla kullanmak için bir yöntem yayınladı. Duchenne musküler distrofi farelerinin kas fonksiyonunu değişen derecelerde onarabilen Distrofin genini düzenlemek için CRISPR sistemini kullandılar ve böylece DMD'yi tedavi etme etkisini elde ettiler. . 2018'de yapılan bir araştırma, CRISPR teknolojisinin dört köpeği DMD (Duchenne kas distrofisi) ile başarılı bir şekilde tedavi etmek ve kas ve kalp dokularındaki distrofini normal seviyenin% 92'sine geri yüklemek için kullanıldığını doğruladı. . Ek olarak CRISPR teknolojisi, CAR-T tedavisini tamamlamak ve farelerde tümör baskılamasını artırmak için hücresel immünoterapi ile birleştirilir. T hücrelerinde PD-1 genini ortadan kaldırmak için CRISPR-Cas9 kullanan ilk klinik çalışma, kas invaziv mesane kanseri, kastrasyona dirençli prostat kanseri, metastatik böbrek kanseri ve metastatik küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin tedavisi için onaylandı. Faz I klinik araştırma 2016'da başladı .
4. CRISPR'nin diğer uygulamaları
Şu anda CRISPR sadece genom düzenlemede kullanılmıyor, aynı zamanda genetik testlerde de büyük bir potansiyel gösteriyor. Science tarafından 2017 yılında yayınlanan bir çalışmada, Doudna'nın ekibi ilginç bir fenomen keşfetti: CRISPR sistemi hedeflenen çift sarmallı DNA'yı kestiğinde, Cas12'nin DNaz aktivitesi aktive olur. . Bu keşif, belirli bir hedef DNA'nın bir hücrede bulunup bulunmadığını tespit etmek için yeni bir fikir sağlar: Hedef tespit edildiğinde, eşzamanlı olarak DNA'yı hedefleyen bir CRISPR-Cas12a sistemi ve spesifik olmayan bir ssDNA floresan raportör geni (FQ etiketli raportör) hücreye iletin. DNA, CRISPR-Cas12a sistemi aktive edilecek ve aynı zamanda floresan raportör gen de bir floresan sinyal salmak için bozunacak. Doudna'nın ekibi, bu teknolojiyi kullanarak, HPV 16 enfeksiyonunu bir saat içinde% 100 doğru bir şekilde tespit edebilen DETECTR sistemini geliştirdi ve tek bir testin maliyeti bir dolardan az. Zhang Feng'in ekibi aynı zamanda SHERLOCK sistemini ve SHERLOCKv2 sistemini geliştirmek için CRISPR-Cas13a'yı da kullandı. Doudna'nın ekibinden farklı olarak, Feng Zhang'ın ekibi tarafından tasarlanan flüoresan haberci gen spesifik olmalıdır ve SHERLOCKv2'nin aynı anda birden fazla diziyi tespit etmesine izin veren "özgüllüğün" avantajıdır. Zhang Feng'in ekibi ayrıca hamilelik test çubuğuna benzer bir test şeridi test yöntemi geliştirdi.Sadece bir test şeridi ile SHERLOCKv2 virüs enfeksiyonunun test sonuçlarını gösterebilir ve bu da testi daha kolay hale getirir. Bu yıl COVID-19 için algılama teknolojisinin geliştirilmesinde SHERLOCKv2 yeteneklerini de gösterdi.
DETECTR ve SHERLOCK bize tanı koymadaki güçlerini göstermiş olsalar da, araştırmacıların klinik kullanıma girmeden önce tanının doğruluğunu sağlamak için hala çok iş yapması gerekiyor. Bu yeni teşhis araçlarının, özellikle viral enfeksiyonların teşhisinde nispeten zayıf sağlık koşullarına ve yüksek virüs enfeksiyonlarına sahip gelişmekte olan ülkeler için gelecekteki teşhis tekniklerini yeniden yazacağına inanıyoruz. .
Referanslar
1. Doudna JA, Charpentier E. Genom düzenleme. CRISPR-Cas9 ile genom mühendisliğinin yeni sınırı. Science. 2014 Kasım 28; 346 (6213): 1258096. Doi: 10.1126 / science.1258096. PMID: 25430774 .
2. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Escherichia coli'de alkalin fosfataz izozim dönüşümünden ve gen ürününün tanımlanmasından sorumlu iap geninin nükleotid dizisi J Bacteriol. 1987 Aralık; 169 (12 ): 5429-33. Doi: 10.1128 / jb.169.12.5429-5433.1987. PMID: 3316184; PMCID: PMC213968.
3. Lander ES. The Heroes of CRISPR. Cell. 2016 Jan 14; 164 (1-2): 18-28. Doi: 10.1016 / j.cell.2015.12.041. PMID: 26771483.
4. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G. Archaea, Bakteri ve mitokondri genomlarında düzenli aralıklı tekrarlardan oluşan bir ailenin biyolojik önemi Mol Microbiol.2000 Nisan; 36 (1): 244-6. doi: 10.1046 / j.1365-2958.2000.01838.x. PMID: 10760181.
5. Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM. Prokaryotlarda DNA tekrarları ile ilişkili genlerin tanımlanması Mol Microbiol. 2002 Mart; 43 (6): 1565-75. Doi: 10.1046 / j.1365-2958.2002 .02839.x. PMID: 11952905.
6. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E. Düzenli aralıklı prokaryotik tekrarların araya giren dizileri yabancı genetik unsurlardan türetilir. J Mol Evol.2005 Şubat; 60 (2): 174-82. Doi: 10.1007 / s00239-004-0046-3. PMID: 15791728.
7. Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. Yersinia pestis'teki CRISPR öğeleri, bakteriyofaj DNA'sının tercihli alımıyla yeni tekrarlar elde eder ve evrimsel çalışmalar için ek araçlar sağlar.Mikrobiyoloji.2005 Mart; 151 (Pt 3): 653-663. Doi : 10.1099 / mic.0.27437-0. PMID: 15758212.
POURCEL C, SALVIGNOL G, VERGNAUD G. Yersinia pestis'teki CRISPR öğeleri, bakteriyofaj DNA'nın tercihli alımıyla yeni tekrarlar elde ediyor ve evrimsel araştırmalar için ek araçlar sağlıyor
