Li Lanjuan'ın ekibi: Yeni taç mutasyonu patojeniteyi etkiliyor ve in vitro enfeksiyon 270 kat fark gösteriyor
Yeni koronavirüs (SARS-CoV-2) hakkındaki mevcut genomik araştırma verileri, virüsün çok sayıda tek nükleotid varyantına (SNV) sahip olduğunu göstermektedir. Önceki hiçbir çalışma, mutasyonların doğrudan virüsün patojenitesindeki fonksiyonel değişikliklerle ilişkili olduğunu göstermemiştir.
Bununla birlikte, Akademisyen Li Lanjuan ekibinin son araştırması, yeni koronavirüsün genomunda şu anda meydana gelen mutasyonların, virüsün patojenitesini etkilemek için fonksiyonel potansiyele sahip olduğuna dair doğrudan kanıt sağladı.
Son çalışmada, Zhejiang Üniversitesi'nden bir araştırma ekibi, tümü en az bir mutasyona sahip olan COVID-19 hastalarından türetilen 11 virüs izolatının işlevsel özelliklerini bildirdi. Önemli olarak, Vero-E6 hücrelerini enfekte ederken, bu virüs izolatları sitopatik etki ve viral yükte 270 kata varan bir farkla önemli farklılıklar gösterdi.
19 Nisan'da, yerel saatte, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi, Zhejiang Üniversitesi Yaşam Bilimleri Araştırma Enstitüsü ve Zhejiang Eyaleti Pankreas Hastalıkları Ana Laboratuvarı'nın İlk Bağlı Hastanesinin Bulaşıcı Hastalık Teşhis ve Tedavisi Devlet Anahtar Laboratuvarı araştırma ekibi medRxiv tıbbi ön baskı platformunda bir çevrimiçi yayın yayınladı. "Hastadan türetilen mutasyonlar SARS-CoV-2'nin patojenitesini etkiler" adlı bir araştırma makalesi. Makalenin ilgili yazarları, Çin Mühendislik Akademisi akademisyeni ve Ulusal Sağlık Komisyonu'nun üst düzey uzman grubunun bir üyesi olan Profesör Li Lanjuan, Zhejiang Üniversitesi Yaşam Bilimleri Enstitüsü'nde araştırmacı olan Jiang Chao ve Zhejiang Üniversitesi İlk Bağlı Hastanesindeki Enfeksiyon Hastalıkları Devlet Anahtar Laboratuvarı'ndan Profesör Wu Nanping ve Zheng'dir. Profesör Min.
Mevcut araştırma, transmembran sivri glikoproteinin (S proteini) virüsü konakçı hücrelere aracılık ettiğine ve S proteininin protein yapısı ve fonksiyonuna göre S1 ve S2 protein alt birimleri olmak üzere iki işlevsel birime bölündüğüne inanmaktadır. Bunların arasında S1, konakçı hücre reseptörlerine bağlanmaktan, S2 ise virüs ve hücre zarı füzyonundan sorumludur. Hem yeni koronavirüs hem de SARS-CoV, hedef hücrelere girmek için anjiyotensin dönüştürücü enzim 2'yi (ACE2) kullanır. ACE2, insan nazal epitel hücrelerinde ve akciğerde, spermatogonia'da, mezenkimal hücrelerde, Sertoli hücrelerinde, mide, duodenal ve rektal epitel hücrelerinde ifade edilir.
Makale, S proteininin reseptör bağlanma alanının (RBD), p koronavirüs genomunun en değişken kısmı olduğundan ve S proteininin belirli bölgelerinin pozitif seçime tabi olabileceğinden bahsetti. Bununla birlikte, yeni koronavirüsteki büyük miktarda değişkenliğe rağmen, kilit bir soru var: Bu mutasyonların yeni koronavirüsün patojenitesi üzerinde herhangi bir gerçek işlevsel etkisi var mı?
Araştırmacılar, yukarıda belirtilen sorunların viral enfeksiyon mekanizmasını anlamak ve pandeminin bir sonraki aşamasına hazırlanmak için ilaç ve aşıların geliştirilmesine rehberlik etmek için çok önemli olduğuna inanıyor. Bu sorunu çözmek için araştırmacılar, Zhejiang Üniversitesi İlk Bağlı Hastanesine kabul edilen hastalardan 11 yeni koronavirüs suşunu izole etti.
Araştırmacılar, Novaseq 6000 platformunda 11 virüs izolatının ultra derin sekansını gerçekleştirdi ve virüs izolatlarının kodlama sekansının sırasıyla 1-5 mutasyona sahip olduğunu ve karışık popülasyonların (virüs benzeri türler, Yarı türler) gözlemlendiğini buldular. Toplam 33 mutasyon tanımladılar (karışık bir popülasyonda gözlemlenen 10 mutasyon dahil) 24 Mart 2020'de GISAID tarafından sağlanan 1111 genom sekansıyla yapılan bir karşılaştırmaya dayanarak, bunlardan 19'u yeni mutasyonlardı.
Araştırmacılar ayrıca Vero-E6 hücrelerini 11 virüs izolatı ile enfekte etti ve viral yüklerini enfeksiyondan 1, 2, 4, 8, 24 ve 48 saat sonra (PI) ve enfeksiyondan 48 ve 48 saat sonra nicel olarak değerlendirdiler. 72 saatlik viral sitopatik etkiler (CPE).
Araştırma sonuçları, Vero-E6 hücrelerini enfekte ederken, gözlemlenen mutasyonların viral yük ve sitopatolojik etkiler üzerinde 270 kata kadar bir farkla doğrudan bir etkiye sahip olduğunu gösterdi. Bu bulgu, çalışmada gözlemlenen virüs mutasyonlarının yeni koronavirüsün patojenitesini önemli ölçüde etkileyebileceğini ve bu mutasyonun dünya çapında toplanan virüs suşlarında var olabileceğini göstermektedir.
Genel olarak, bu çalışma, yeni koronavirüsün genomunda şu anda meydana gelen mutasyonların, virüsün patojenitesini etkilemek için fonksiyonel potansiyele sahip olduğuna dair doğrudan kanıt sağlar. Araştırmacılar, sürekli genom dizileme verilerinin birikmesine ek olarak, virüs izlemenin mümkün olduğunca hücresel düzeyde yapılması gerektiğini hatırlattı. Son olarak, influenzaya benzer şekilde, ilaçların ve aşıların geliştirilmesi acil olmasına rağmen, potansiyel kusurlardan kaçınmak için bu kümülatif mutasyonların, özellikle ata mutasyonlarının etkisini de göz önünde bulundurmak gerekir.
Hastanın epidemiyolojik geçmişi
Bu çalışmaya dahil olan 11 hastanın örnekleri, 22 Ocak 2020'den 4 Şubat 2020'ye kadar yerli salgının erken aşamasında toplandı.
11 hastadan 10'unun Wuhan ile net bir ilişkisi var, bu 11 kişiden 5'i tanıdan önce Wuhan'da çalıştı ya da seyahat etti, diğer 5'i Wuhan'da yaşayanlarla yakın temas halindeydi ve geri kalan 1'i yeni taç hastasıydı. Temas kurdu. Wuhan'dan meslektaşlarının katıldığı aynı iş toplantısına ZJU-4, ZJU-5 ve ZJU-9 hastalarının hepsinin katıldığını belirtmek gerekir.
Dolayısıyla bu 11 hastanın epidemiyolojik geçmişine göre birinci ve ikinci kuşak enfeksiyon vakalarını oluşturmaktadırlar.
Yaşları 4 ay ile 71 yaş arasında değişen 11 hastanın 8'i erkek, 3'ü kadındı. 1 hasta dışında diğer tüm hastaların semptomları orta veya şiddetli idi, 3'ünde komorbidite vardı ve 1'i YBÜ tedavisi gerektiriyordu.
Bu yazının yazıldığı tarih itibariyle tüm hastalar iyileşmiştir.
11 hastadan toplanan virüs izolatlarında çok sayıda mutasyon var
Araştırmacılar, bu 11 virüs izolatının mutasyon profillerini değerlendirmek için Illumina Novaseq 6000 platformunda izole edilmiş viral genomik RNA'nın ultra derin dizilişini gerçekleştirerek örnek başına ortalama 245 milyon okuma / 67,16 Gb üretti.
Toplam 33 mutasyon tanımladılar (karışık bir popülasyonda gözlemlenen 10 mutasyon dahil) 24 Mart 2020'de GISAID tarafından sağlanan 1111 genom sekansıyla yapılan bir karşılaştırmaya dayanarak, bunlardan 19'u yeni mutasyonlardı.
Spesifik olarak, G11083T ve G26144T, her ikisi de büyük bir virüs popülasyonunun ata mutasyonları olarak kabul edilen ZJU-1'de bulundu. ZJU-2 ve ZJU-8'de C8782T ve T28144C mutasyonları bulundu.Bu iki mutasyon, başka bir büyük virüs izolatı grubunun ata mutasyonları olarak kabul edilir.
T22303G mutasyonu, beş virüs izolatında bulundu: ZJU-2, ZJU-5, ZJU-9, ZJU-10 ve ZJU-11. ZJU-5 ve ZJU-9, bir iş toplantısında aynı potansiyel enfeksiyona maruz kaldı kaynak. T22303G mutasyonunun daha önce yalnızca Avustralya'da izole edilen virüs türlerinde tanımlandığını belirtmek gerekir.
ZJU-5 ve ZJU-9 ile aynı toplantıya katılan hasta ZJU-4'ün virüs izolatının, protein seviyesinde (S proteininde S247R) T22303G ile aynı etkiye neden olan yeni bir mutasyon A22301C'ye sahip olduğunu belirtmek gerekir. Yanlış mutasyon.
Son olarak, ZJU-11, ORF7b geninde 3'ü sürekli olan 4 mutasyona sahiptir ve protein seviyesinde 2 mutasyon ortaya çıkmıştır.
Araştırmacıların, GISAID'deki sekans verilerinin virüsün bireyler arası varyasyonunu izlemek için çok yardımcı olmasına rağmen, virüsün bireysel evrimsel dinamikleri hakkında hala çok az şey bildiğimize inandıklarını belirtmek gerekir. Örneğin, ZJU-4 ve ZJU-10'da, iki bağımsız lokusun alel frekansı dağılımları çok benzerdir, bu da iki lokusun ilişkili olabileceğini gösterir, bu da virüs popülasyonunda en az iki haplotip olduğunu gösterir. yazın.
Genel olarak, bu çalışmada hastalardan yalnızca 11 virüs suşu analiz edilmiş olsa da, araştırmacılar halen küresel olarak dolaşan farklı ana virüs kümelerinde birkaç temel mutasyon dahil olmak üzere çeşitli mutasyonlar gözlemlediler. Bu çeşitli mutasyon spektrumu, nispeten erken örnekleme zamanları ve Wuhan'a nispeten yakın yakınlıkları ile tutarlıdır. Bununla birlikte, sınırlı örnek boyutu nedeniyle, Wuhan'daki erken virüslerin tam mutasyon çeşitliliği hala belirsizdir.
Araştırmacılar, şu anda küresel nüfusu enfekte eden iki ana virüs türünün iki set ata mutasyonu dahil olmak üzere 11 virüs izolatında çeşitli mutasyonların bulunduğunu tartıştı ve işaret etti. Ek olarak, nispeten erken örnekleme tarihine rağmen, belirlenen 31 mutasyondan 19'u yeniydi ve bu da virüs suşlarının gerçek çeşitliliğinin hala büyük ölçüde yeterince tanınmadığını gösteriyor.
Ek olarak, 5 virüs suşunun hepsinde T22303G mutasyonu gözlemlendi.Bu spesifik mutasyon, erken salgında ortaya çıktı ve önemli sayıda Wuhan insanında mevcut olabilir. Bu mutasyonun ata etkisinden kaynaklanıyor olabilir.Bu etki altında, T22303G mutasyonu erken aşamada Çin'den yayılmadı.
ZJU-11'in trinükleotid mutasyonunun beklenmedik olduğuna dikkat etmek önemlidir. Araştırmacılar, bu özel virüs izolatının çalışmada hem viral yükte hem de CPE belirlemede çok "güçlü" göründüğünü fark ettiler. Kaynaklandığı hasta da 45 gün boyunca yeni kron pozitifliği için çok nadirdi ve kısa süre önce hastaneden taburcu edildi.
Bu tür trinükleotid mutasyonlarının işlevsel etkilerini araştırmanın çok ilginç olacağına inanıyorlar. Mevcut veri tabanında başka bir trinükleotid mutasyonunun (G28881A, G2882A ve G28883C) tanımlandığını ve bunun da protein seviyesinde iki yanlış mutasyona neden olduğunu belirtmek gerekir.
Araştırmacılar ayrıca, dışkı örneklerinden canlı virüs elde edilemeyeceğine dair son raporun aksine, bu çalışmada üç virüs izolatının dışkı örneklerinden çıkarıldığını hatırlattı.Çalışma, yeni koronavirüsün dışkı örneklerinde çoğalabileceğini gösterdi.
Filogenetik analiz, farklı evrimsel tarihi ortaya çıkarır
Araştırmacılar, mevcut yeni koronavirüs dizileme verilerinden 11 virüs izolatının filogenetik arka planını anlamak için GISAID'den 725 yüksek kaliteli, yüksek kapsamlı yeni koronavirüs genomu elde etti (21 Mart 2020'de indirildi). RaTG13 virüs suşu ve Yunnan Çin krizantem yarasasından 2013 yılında dış grup olarak toplanan Guangdong pangolin virüsü suşu dahil.
Araştırmacılar, 736 virüs sekansı içeren maksimum olasılıklı bir filogenetik ağaç inşa ettiler ve ortaya çıkan filogenetik ağaç temelde GISAID üzerindeki güncellenmiş filogenetik analiz ile tutarlı.
Araştırmalar oldukça fazla ata mutasyonu gözlemledi. Spesifik olarak, bu filogenetik analizde, araştırmacılar aşağıdaki en büyük üç kümeyi fark ettiler: Birincisi, 231 viral dizide üç nükleotid mutasyonu C241T, C14408T ve A23403G (S-D614G kümesi) bulundu. Bunların çoğu izole edilmiş ve Avrupa'da elde edilmiştir; ikinci olarak 208 virüs sekansında iki nükleotid mutasyonu C8782T ve T28144C (ORF8-L84S kümesi) bulunmuştur.Bu analizde monojenik değildirler (Şekil 2A ve Şekil S3). ). Bununla birlikte, ORF8-L84S kümesindeki 92 genom sekansında, esas olarak Seattle, ABD'den (ORF8-L84S-USA-WA-clade) virüs sekanslarından oluşan farklı bir tek kaynaklı alt sınıf gözlenebilir; üçüncü , Çoğu Hollanda ve Birleşik Krallık'tan gelen 34 viral dizide iki nükleotid mutasyonu G11083T (ORF1a'da L3606F) ve G26144T (ORF3a'da G251V) bulundu.
Araştırmacılar, farklı ata mutasyonları kümeleriyle tanımlanan birkaç küçük tek kaynaklı kümenin de gözlemlenebileceğini belirtti. Örneğin: G1937A (ORF1a'da V378I) mutasyonları, birinci ve 31 viral sekanslarda bulundu; G1440A ve G2891A mutasyonları, ikinci ve 12 viral sekanslarda bulundu ve ORF1a geninde, çoğunlukla Almanya'dan G392D ve A876T mutasyonları ile sonuçlandı. Hollanda; Çin veya Japonya'dan N geninin P344S mutasyonuna neden olan üçüncü ve sekizinci genom dizilerinde C15325T ve C29303T mutasyonları bulundu.
Araştırmacılar, 11 virüs izolatını filogenetik analize entegre ettiler ve bunlar filogenetik alana dağıldılar. ZJU-1, ORF1a-L3606F ve ORF3a-G251V grupları ile kümelenmiştir ve bu iki tipik mutasyona sahiptir. Öte yandan, ZJU-8 ve ORF8-L84S'li ZJU-2 kümeleri ve hepsinin iki ata mutasyonu vardır. Yukarıda bahsedilen T22303G mutasyonu nedeniyle, ZJU-9 ve ZJU-11 bir Avustralya izolatı ile kümelenmiştir. Diğer suşlar ya daha az mutasyona sahipti ya da bilinen büyük ölçekli popülasyonlarla kümelenen yeni mutasyonlara sahip değildi, bu 11 örneğin geniş çeşitliliğini yansıtıyordu.
Özetle, araştırmacılar, bazı tek kaynaklı virüs gruplarının belirgin coğrafi modeller gösterdiğine inanıyorlar (özellikle Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri), ancak bunun nedeni, pandeminin erken aşamalarındaki ilgili mutasyonlarının "atadan kalma etkisi" olabilir.
Vero-E6 hücrelerini enfekte ederken, virüs kopya sayısı ve sitopatolojik etkilerde önemli farklılıklar vardır.
Şu anda, COVID-19 hastaları çeşitli klinik semptomlar göstermektedir Epidemiyolojik çalışmalar, klinik sonuçların bireysel yaş, komplikasyonlar ve diğer potansiyel olarak bilinmeyen parametrelerden ciddi şekilde etkilendiğini göstermiştir. Araştırmacılar, hastalardan türetilen yeni koronavirüs izolatlarında mutasyonların etkisini tespit etmek için bir in vitro enfeksiyon testi yaptı.
Araştırmacılar ilk olarak virüs izolatının beklendiği gibi Vero-E6 hücrelerine başarılı bir şekilde bağlanıp bağlanamayacağını test etti ve virüs parçacıklarını, S proteini tarafından oluşturulan ikonik "taç" ile görsel olarak tanımladı. Ardından, Vero-E6 hücrelerini 11 hastadan elde edilen virüs izolatlarıyla enfekte ettiler ve enfeksiyondan 1, 2, 4, 8, 24 ve 48 saat sonra hücreleri topladılar. CPE'yi değerlendirmek için 48. ve 72. saatlerde hücrelerin DIC mikrografları alındı.
Yeni koronavirüsün varlığını tespit etmek için ORF1a, E ve N genleri için spesifik gerçek zamanlı transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullandılar. Döngü eşiği Ct, viral yükü ölçmek için kullanılır ve daha düşük bir değer, daha yüksek bir viral yükü gösterir. Bu üç genin sonuçları oldukça tutarlı olduğundan, yalnızca ORF1a geninin sonuçlarını tartışırlar.
Kısaca, tüm virüs izolatı örneklerinin Ct değerleri, enfeksiyondan 1, 2 ve 4 saat sonra sadece küçük dalgalanmalarla stabil kalmıştır. Bu erken zaman noktalarında, virüs parçacıkları istilacı hücrelere bağlanır ve bu aşamada virüs replikasyonu nadiren gerçekleşir.
Enfeksiyondan sekiz saat sonra araştırmacılar, ZJU-6, ZJU-7, ZJU-9, ZJU-10 ve ZJU-11'in Ct değerlerinin önemli ölçüde azaldığını gözlemledi, bu da viral yükün arttığı anlamına geliyor. Enfeksiyondan 24 saat sonra ZJU-2 ve ZJU-7 dışındaki tüm virüs izolatlarının Ct değerlerinin önemli ölçüde düştüğü, ZJU-10 ve ZJU-11 adlı bazı virüs izolatlarının diğer virüslere göre daha hızlı düştüğü görülmüştür. birçok. Enfeksiyondan kırk sekiz saat sonra, ZJU-10 ve ZJU-11 dışındaki tüm virüs izolatlarında hafif bir düşüş görüldü.Araştırmacılar, hem ZJU-10 hem de ZJU-11'in 24 saatte stabilize olduğunu tahmin ettiler.
Enfeksiyondan 24 saat sonra, ORF-8-L84S küme üyeleri ZJU-2 ve ZJU-8'in (çoğunlukla Seattle, Washington, ABD'den) viral yükünün önemli ölçüde azaldığını belirtmek gerekir. Öte yandan, S-D614G şubesiyle aynı kümedeki ZJU-1'in viral yükü (esas olarak Avrupa'da bulunur) ZJU-2 ve ZJU-8'in 19 katıdır. Ek olarak, enfeksiyondan 24 saat sonra, ZJU-10 ve ZJU-2'nin viral yükü yaklaşık 270 kat farklılık gösterdi.
Makale, bu farklılıkların 48 saatte istatistiksel olarak önemli hale geldiğini ve E ve N genlerinin verilerini analiz ederken tekrarlanabilir olduğunu belirtiyor. Bu nedenle araştırmacılar, farklı virüs izolatlarının, genomlarındaki farklı mutasyonlarla belirlenen Vero-E6 hücrelerini enfekte ettiklerinde önemli viral yük değişiklikleri gösterdiğine inanıyorlar.
Daha sonra araştırmacılar, viral yükteki bir artışın daha fazla hücre ölümüne neden olup olmadığını test ettiler. Enfeksiyondan 48 saat ve 72 saat sonra bu hücre hatlarının mikroskop altında gözlenmesi, CPE veya hücre ölüm oranı viral yük verileriyle oldukça tutarlıydı, bu da viral yük ne kadar yüksekse hücre ölüm oranının o kadar yüksek olduğunu gösteriyor.
Tartışma oturumunda, hastalar tarafından gösterilen çok çeşitli klinik semptomlar nedeniyle hastalarda genotip ve fenotip arasındaki ilişkiyi kurmanın çok zor olacağını söylediler. In vitro hücre hatları, farklı izole edilmiş virüs suşlarındaki mutasyonların etkilerini incelemek için ideal bir sistem sağlar.
Vero-E6 hücre çizgisinin insanlardan türetilmemesine rağmen, Vero-E6 hücre çizgisinin ACE2 proteininin, yeni koronavirüsün hücre çizgisini enfekte edebileceğini doğrudan kanıtlayan insan ACE2 proteinine oldukça benzer olduğuna inanıyorlar.
