Reseptör araştırması, yeni kronun ara konukçu aralığının SARS'tan daha dar olduğunu ve pangolin olasılığının daha düşük olduğunu ortaya koymaktadır.
Son yıllarda, koronavirüs salgını küresel halk sağlığı için büyük bir tehdit oluşturdu. Tipik bir örnek, SARS virüsünün 2003 yılında SARS salgınına neden olması ve SARS-CoV-2'nin geçen yılın sonundan bu yana COVID-19 salgınına neden olmasıdır. Her iki virüsün de yarasalardan kaynaklandığına ve bir pandemiye neden olması için türler arasında doğrudan veya dolaylı olarak yayılması gerektiğine inanılıyor.
Alıcı kullanımı, bir virüsün konakçı aralığını belirlemede önemli bir faktördür ve konakçı aralığı, virüs türlerinin yayılmasının anahtarıdır. Çin'den yapılan en son araştırma, alıcıyı giriş noktası olarak aldı ve yeni koronavirüsün ara konakçı aralığının SARS'tan daha dar olduğunu buldu. Tavukların ve farelerin olasılığı düşüktür ve pangolin olasılığı da yüksek değildir, çünkü pangolin koronavirüsü tarafından ACE2'nin kullanım oranı SARS-CoV-2'den SARS-CoV'ye daha yakındır; somon gibi balık ve sürüngenler mümkün değildir. Ara konaktır.
Son zamanlarda, Hunan Üniversitesi Biyoloji Okulu'ndan bir araştırma ekibi, biyoloji alanında bioRxiv ön baskı platformu hakkında "Anjiyotensin dönüştürücü enzim 2'nin (ACE2) reseptör kullanımı, SARS-CoV-2'nin ev sahibi aralığından daha dar olduğunu gösterir" başlıklı bir makale yayınladı. SARS-CoV ". Makalenin ilgili yazarı, Hunan Üniversitesi Biyoloji Okulu Patojenik Biyoloji ve İmmünoloji Enstitüsü'nde profesör olan Ge Xingyi'dir.
Anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2), SARS-CoV ve SARS-CoV-2 için reseptördür, ancak virüs tarafından yalnızca belirli hayvanlarda ACE2 kullanılabilir. Bu çalışmada, araştırma ekibi, bu iki virüsün 20 hayvanda ACE2 reseptörlerini kullanma yeteneğini değerlendirmek için psödovirüs giriş deneyleri kullandı. Çalışma, SARS-CoV-2'nin SARS-CoV'den daha az hayvan ACE2 türü kullandığını buldu, bu da SARS-CoV-2'nin konukçu aralığının daha dar olduğunu gösteriyor. Aynı zamanda, SARS ile ilgili başka bir koronavirüs olan pangolin koronavirüs, SARS-CoV-2'ye oldukça homolog bir genoma sahiptir, ancak ACE2 kullanımı SARS-CoV-2'ye değil SARS-CoV'ye benzer. .
Reseptör kullanım mekanizmasını açıklığa kavuşturmak için araştırma ekibi, 20 hayvandaki ACE2'nin amino asit dizilerini karşılaştırdı ve SARS-CoV, SARS-CoV-2 ve pangolin kronları dahil ACE2 kullanımı için gerekli olabilecek 5 amino asit kalıntısı buldu. Farklı virüs reseptörleri tarafından kullanılan 20. ve 42. amino asit N-terminali.
Araştırmacılar, çalışmanın pandemik koronavirüs reseptörlerinin kullanımının anlaşılmasını teşvik ettiğini ve virüs izleme, ara konak taraması ve patojenik koronavirüslerin salgın önlenmesi ve kontrolü için faydalı olabileceğini belirtti.
SARS-CoV ve SARS-CoV-2 gibi yüksek derecede patojenik koronavirüs salgınının ana nedeni türler arası bulaşmadır. Önceki virüs izleme çalışmaları, Çin krizantem yarasasının SARS-CoV'nin doğal konakçısı olduğunu göstermiştir. Son filogenetik analizler, SARS-CoV-2'nin yarasa ile ilişkili SARS virüsünden de kaynaklanabileceğini göstermiştir. Rakun ve rakun gibi bazı küçük memeliler, SARS-CoV'nin ara konakçıları olabilir ve 2003'ün başlarında SARS salgınının doğrudan kaynağı olabilir, çünkü SARS-CoV bu hayvanlardan başarıyla izole edilebilir. Benzer şekilde, SARS-CoV-2'ye benzer bir virüs de Malay pangolininde bulundu, bu da pangolinin SARS-CoV-2'nin ara konağı olabileceğini gösterir.
Ara konakçı hayvan, doğal virüs konakçı insanlara yayıldığında önemli bir rol oynar ve virüsün konakçı aralığı, ara konağın belirlenmesinde önemli bir faktördür. Bir virüsün konakçı aralığını belirleyen ana faktör, virüs ve konakçı hücre üzerindeki reseptör arasındaki tanıma ve bağlanmadır. Hem SARS-CoV hem de SARS-CoV-2, bir hücre reseptörü olarak anjiyotensin dönüştürücü enzim 2'yi (ACE2) kullanır.
ACE22000 yılında keşfedildi ve başlangıçta kalp ve böbreğin vasküler endotel hücrelerinde ifade edilen ve anjiyotensinin dönüşümünü katalize edebilen bir ekzopeptidaz olduğu düşünülüyordu. ACE2 yüksek oranda korunur ve çoğu omurgalıda yaygın olarak ifade edilir, ancak tüm ACE2, SARS-CoV ve SARS-CoV-2 için bir reseptör görevi göremez. Örneğin, SARS-CoV fare ACE2'yi bir reseptör olarak kullanabilir, ancak SARS-CoV-2 bunu yapamaz, bu da farelerin SARS-CoV-2 değil, SARS-CoV için potansiyel konakçılar olduğunu gösterir.
Araştırmacıların önceki çalışmaları, SARS-CoV-2 tarafından ACE2'nin kullanımını öngörmüş ve SARS-CoV-2'nin fare ACE2'leri ve bazı kuş ACE2'leri dışında çoğu memeli ACE2'sini kullanabileceğini göstermiştir. Aynı zamanda, araştırmacılar ACE2'de SARS-CoV-2'nin kullanımı için kritik olan 9 amino asit kalıntısını da tahmin ettiler.
Bu çalışmada, araştırmacılar, ACE2 ekspresyonu doğal olarak eksik olan HeLa hücrelerinde in vitro 20 farklı hayvandan ACE2 ifade ettiler. Hücreler daha sonra, ACE2 kullanımlarını test etmek için koronavirüs spike proteinini taşıyan psödoviral partiküller ile enfekte edildi. Sonuçlar, hem SARS-CoV hem de SARS-CoV-2'nin çoğu memelinin ACE2'sini reseptör olarak kullanabildiğini, balıkların ve sürüngenlerin bunu yapamayacağını gösterdi.
İlginç bir şekilde, fare ACE2'ye benzer şekilde, SARS-CoV tavuk ACE2'yi kullanabilir, ancak SARS-CoV-2 kullanamaz Bu, SARS-CoV-2'nin özellikle farelerde ve kuşlarda dar bir konakçı aralığına sahip olduğunu gösterir. Araştırmacılar ayrıca, SARS-CoV-2'ye oldukça benzer bir diken yapısına sahip olan pangolin koronavirüs psödovirüsünü de test ettiler. Araştırmacıların sürprizine göre, pangolin koronavirüsün ACE2 kullanım oranı SARS-CoV'ye benzer, ancak SARS-CoV-2'ye benzemiyor.
20 ACE2 amino asit dizisinin hizalanmasıyla, araştırmacılar ayrıca T20, K31, Q42, Y83, vb. Amino asit kalıntılarının ACE2 reseptörlerini kullanması için SARS-CoV-2 için gerekli olduğunu, Y41, K68 ve diğer önemli amino asit kalıntılarını doğruladı. O değil. Özellikle, ACE2'nin T20 amino asit kalıntıları, SARS-CoV-2 spike proteininin reseptör bağlanma motifinde (RBM) S477 ve T478 ile etkileşime girebilir ve spike protein-ACE2 bağlanmasında anahtar bir rol oynayabilir. Bununla birlikte, ACE2'nin SARS-CoV ve pangolin koronavirüs sivri uçları ile kombinasyonu gerekli değildir. Bu amino asit kalıntıları, SARS-CoV-2'nin benzersiz reseptör kullanımını ve konakçı aralığını kısmen belirleyebilir. Özet olarak, araştırmacıların araştırması, SARS-CoV-2'nin ACE2 kullanımının daha net bir şekilde anlaşılmasını sağlar; bu, virüs-reseptör etkileşimini ve SARS-CoV-2'nin konakçı aralığını daha iyi anlamaya yardımcı olabilir.
Pseudovirüs hazırlama ve ACE2 ifadesinin doğrulanması
Bu çalışmada, araştırmacılar ACE2'nin SARS-CoV-BJ01, SARS-CoV-2 ve pangolin koronavirüs dahil olmak üzere SARS ile ilgili üç virüs tarafından kullanımını araştırdılar. Pangolinlerin SARS-CoV-2'nin potansiyel ara konakçıları olduğundan şüphelenildiğinden, araştırmacılar pangolin koronavirüsü test ettiler. 498 amino asit kalıntısı haricinde, pangolin koronavirüs başak proteininin RBM'sinin SARS-CoV-2 başak proteini ile hemen hemen aynı olduğunu, ancak birkaç amino asit pozisyonunda SARS-CoV koronavirüsten farklı olduğunu belirtmek gerekir.
Üç psödovirüsün hazırlanmasının başarısını doğrulamak için, virüs paketlemesi için kullanılan HEK293T hücreleri, virüsleri aldıktan sonra lize edildi ve hücreleri lizledikten sonra ha-etiketli başak proteinini saptamak için Western blot yapıldı. Üç paketleme hücresinin numunelerinin tümü tipik SARS gösterir
İlgili başak protein bandı (yaklaşık 180 kDa), psödovirüsün başarıyla hazırlandığını gösterir.
Ardından, araştırmacılar HeLa hücrelerinde farklı hayvanlardan 20 ACE2'nin ektopik ifadesini doğrulamaya devam ettiler. Araştırmacılar, HeLa hücrelerini farklı hayvanlardan ACE2 kodlayan genleri içeren plazmidlerle transfekte ettiler. Tüm ACE2 bantları (yaklaşık 150 kDa) transfeksiyondan 48 saat sonra gözlemlenebilir, bu da tüm ACE2'lerin HeLa hücrelerinde başarıyla ifade edildiğini gösterir.
SARS-CoV ve SARS-CoV-2'nin ACE2 kullanımı arasındaki fark
Araştırmacılar, HeLa hücrelerini kontrol olarak transfekte etmek için farklı ACE2 ifade eden 20 plazmit veya boş vektör kullandı. Transfeksiyondan 48 saat sonra, hücreler SARS-CoV-BJ01, SARS-CoV-2 veya pangolin koronavirüs psödovirüs ile enfekte edildi. 48 saatlik enfeksiyondan sonra, hücreler lize edildi ve hücrelere giren farklı ACE2 aracılı psödovirüslerin etkinliğini değerlendirmek için lusiferaz için test edildi.
Boş bir vektörle transfekte edilmiş ve üç psödovirüsün herhangi biriyle enfekte HeLa hücrelerinin örneklerinde ışıldayan sinyal gözlenmezse, bu, ACE2'siz doğal HeLa'nın psödovirüslerin girişine aracılık edemeyeceği anlamına gelir. Kabuklu, timsah veya engerek ACE2 ifade eden hücrelerin floresans sinyali çok düşüktür, bu da balık ve sürüngen ACE2'nin psödovirüslerin girişine neredeyse hiç aracılık edemediğini gösterir. ACE2 ifade eden tavuklar veya fareler SARS-CoV-BJ01 psödovirüs ile enfekte olduğunda ancak SARS-CoV-2 psödovirüs ile enfekte olmadığında, ACE2 ifade eden hücreler güçlü bir lüminesans sinyali gösterir, bu da SARS-CoV-BJ01'in kullanılabileceğini gösterir. Tavuk veya fare ACE2 hücreye girer, ancak SARS-CoV-2 giremez. Pangolin koronavirüsü, ACE2'yi tavuklarda ve farelerde kullanma yeteneğine sahiptir, ancak tavuk ACE2'deki kullanım etkinliği SARS-CoV-BJ01'den çok daha düşüktür. Aksine, yarasa ACE2 ifade eden hücrelerde, SARS-CoV-2 psödovirüsleri, SARS-CoV-BJ01 veya pangolin koronavirüs psödovirüslerinden daha güçlü floresan yayar, bu da SARS-CoV-2'nin yarasa ACE2'yi kullanma konusunda en güçlü yeteneğe sahip olduğunu gösterir. . Diğer ACE2'ler için, üç psödovirüsün enfeksiyonu, üç SARSr-CoV'nin geniş bir ACE2 aralığı kullanabildiğini gösteren güçlü lüminesans sinyalleri üretti.
ACE2s reseptörünün filogenetik analizi ve SARS-CoV-2 tarafından kullanılan anahtar amino asitler
Araştırma ekibi, yukarıdaki 20 ACE2'nin filogenetik ilişkisini değerlendirmek için, tüm ACE2'nin amino asit dizisine dayalı bir filogenetik ağaç oluşturdu.
Memelilerin, kuşların, sürüngenlerin ve balıkların farklı dallarını gözlemlediler. Memeli ACE2'de, SARS-CoV-BJ01 veya SARS-CoV-2 psödovirüs tarafından kullanılan ACE2'ye karşılık gelen önemli bir dal yoktur, bu, tüm dizi analizinin reseptörün virüs kullanımının anahtar faktörlerini ortaya çıkarmanın zor olduğunu gösterir.
SARS-CoV-2'nin insan, yarasa, misk kedisi, domuz ve fare ACE2'lerinde kullanımına dayanan araştırma ekibi tarafından yapılan önceki araştırmada, insan ACE2'de reseptör kullanımı için kritik olabilecek 9 amino asit bölgesi tahmin ettiler. , T20, K31, Y41, K68, Y83, K353, D355, R357 ve M383 dahil.
Bu çalışmada, araştırma ekibi 15 diğer türü test etti ve daha sonra bu 9 bölgenin SARS-CoV-2 kullanımındaki rolünü doğrulamak için 20 ACE2'nin 9 bölgesini kontrol etti.
Şekil 3A'da gösterildiği gibi, Y / H41, D355, R357 ve R383 tüm ACE2'lerde korunur, bu da bu sitelerin reseptör üzerinde SARS-CoV-2 kullanımını belirleyemediğini gösterir. Benzer şekilde K68, farelerin ve tavukların ACE2'lerinde korunur ve SARS-CoV-2 tarafından kullanılamaz ve SARS-CoV-2'nin kullanımı için önemli olmayabilir. Q42 fare ACE2'de korunur ve tavuk ACE2'de E42 ile değiştirilir SARS-CoV-2'deki rolü karmaşık olabilir. Buna karşılık araştırma ekibi, mevcut ACE2'lerdeki T20, K31 ve Y83'ün mevcut olmayan ACE2'lerden farklı olduğunu buldu ve bu da SARS-CoV-2 kullanımında belirleyici bir rol oynadıklarını gösterdi.
Bununla birlikte, bu çalışmanın sınırlaması, esas olarak amino asit analizine dayanması, deneysel kanıtların olmaması ve SARS-CoV-2'nin konukçu aralığını netleştirmenin zor olmasıdır.
