Çinli ve Amerikalı bilim adamları, beş yıl önce SARS benzeri yeni koronavirüsü çıkarıp üretti ve bu da büyük sosyal riskleri müjdeledi | Titanium Media Science Popularization
İnsan koronavirüsünün (Koronavirüs) çizimi (Kaynak: Science Photo Library)
Çin'in Wuhan kentinde başlayan yeni koronavirüs pnömonisi salgını dikkat çekmeye devam ediyor. 21 Ocak'ta yeni koronavirüsün "insandan insana bulaşması" gerektiği doğrulandığından, tüm insanları kapsayan bir anti-salgın savaş resmen Çin ve dünyada başladı. Güney Çin Deniz Ürünleri Pazarı'ndaki ilk vakanın teyit edilmesinden bu yana Aralık 2019'dan itibaren SARS koronavirüse çok benzeyen tanımlanamayan virüs pnömonisi yeni koronavirüsün yayılmaya başladığı biliniyor.
Bununla birlikte, Titanium Media yakın zamanda yeni koronavirüs ile ilgili araştırmaları dikkatlice incelediğinde ve sıraladığında, 5 yıl kadar erken bir tarihte, 2015 yılında Amerikalı virologların ortak bir Çinli virüs uzmanlarının bir SARS türünü başarılı bir şekilde çıkarması ve tanımlamasına öncülük ettiğini de buldu. Yeni bir tür koronavirüs kimerik virüsü ve daha sonra yapay olarak yeni bir SARS koronavirüs rekombinant virüsü türü üretip yetiştirdi. Bu zamanın araştırma sonuçları, 2015 yılında en iyi uluslararası bilimsel dergi Nature'da da yayınlandı (bundan böyle Nature makalesi olarak anılacaktır).
Bu yıl Wuhan'da yeni koronavirüs pnömonisi patlak verdiğinde, beş yıl önce bu araştırma raporuna dönüp bakıldığında, yine de oldukça şok ediciydi. Beş yıl önce bulunan çalışmanın, bu sefer meydana gelen Wuhan pnömoni virüsü ile tam olarak aynı virüs olduğunu kanıtlamasa da, aslında Sars'a çok benzeyen yeni bir koronavirüstür. Bu yılın Ocak ayında, bazı uzmanlar bu "bilinmeyen zatürre" olarak değerlendirdi. Hızla yayılan, ciddi hastalık oranının yüksek olduğu ve "önlenmesi ve kontrolü" zor olan salgın, dünyada ilk kez meydana geldi, aslında beş yıl önce olmuş ve virüs bilimcileri bunu önceden görmüştü. Durum, bu seferki salgın duruma oldukça benziyor.
Bu araştırma raporu, Amerikalı akademisyenler ve Çinli bilim adamları tarafından ortaklaşa tamamlandı.Yazarlar arasında, Texas Üniversitesi Tıp Dalında Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nde profesör olan Vineet D. Menachery ve Çin Bilimler Akademisi Wuhan Viroloji Enstitüsü'nde araştırmacı olan Zhengli-Li Shi yer alıyor. Kimerik SARS benzeri yeni bir koronavirüsün çıkarılması, keşfi ve üretimi ve yetiştirilmesi, Makaleye göre, virüs farelere SARS (SARS) bulaştırabilir.Virüsün vücuttaki RNA'ya bir protein katıyla bağlandığı, enfekte olduğu ve insan hücrelerine bulaştığı da doğrulanabilir.Raporda, bu tür Sars benzeri yeni koronavirüs olduğu sonucuna varılıyor. Virüsler, çok insandan insana bulaşma özelliklerinden dolayı insanlara büyük sosyal riskler getirebilir.
Beş yıl önceki kehanet gerçekleşti ve bu araştırma raporu da Wuhan salgınının tesadüfi olmayabileceğini gösteriyor.Sars benzeri koronavirüsün mutasyonu ve yayılması hiç durmadı, ancak insanlar buna dikkat etmedi. Yakın zamanda, koronavirüs uzmanı ve Kuzey Carolina'daki Gillings Üniversitesi Küresel Halk Sağlığı Okulu'nda yardımcı doçent olan Timothy Sheahan, Wuhan'ın yeni koroner pnömonisi hakkında yorum yaptı: "Bu" tek seferlik "bir virüs salgını değil, çok muhtemeldir. Gelecekte de olmaya devam edecek. "
Wuhan Viroloji Enstitüsü ile ilgili son zamanlardaki hararetli spekülasyon ve tartışmalara yanıt olarak Shi Zhengli, arkadaş çevresinde yaptığı açıklamada, "Yaşam garantisiyle, 2019 yeni taç virüsünün laboratuvarla hiçbir ilgisi yok. Bu, insanların medeni olmayan yaşam alışkanlıkları için doğanın cezasıdır."
Wuhan Viroloji Enstitüsü'nde araştırmacı olan Shi Zhengli
2015'te ne oldu?
2015 yılında Nature gazetesinde bir arka plan ayrıntılandırıldı. O zamanlar Çin'de at nalı yarasa denen bir yarasa popülasyonu vardı. Bu mağara habitatlarında yaşayan bir grup krizantem yarasası. Vücutlarında SARS benzeri bir yarasa popülasyonu dolaşıyor. Virus-SHC014-CoV ve o sırada şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs (SARS-CoV) ve Orta Doğu solunum sendromu (MERS) -CoV'nin ortaya çıkışı, türler arası bulaşma olaylarının insan toplumuna yönelik tehdidini vurguladı, bu nedenle bilim adamları umuyor At nalı yarasalarında dolaşan bu virüsün patojenik potansiyelini incelemek.
Yarasalar, Ebola virüsü, Marburg virüsü, kuduz virüsü, Hendra virüsü, Nipah virüsü vb. Dahil olmak üzere birçok virüsün doğal konağıdır. Yarasaların özel bağışıklık sistemi nedeniyle, virüs taşırken semptomların görülmesi nadirdir. Uzun evrim süreci içinde yarasalar, yüzlerce virüsün doğal konakçıları haline geldi. Virüs izlenebilirliği çalışması için yarasaların özel bir statüsü vardır ve ilgi odağıdır.
Çinli araştırmacılar, yarasalarda "interferon geni uyarıcı protein-interferon" adı verilen antiviral bir bağışıklık kanalının engellendiğini keşfettiler, bu da yarasaların güçlü bir bağışıklık tepkisini tetiklemeden hastalığa direnebilmesini sağlıyor. Yabani yarasalar birçok virüs taşıyabilir ancak düşük seviyede tutulurlar.
Bu nedenle, Profesör Vineet D. Menachery ve diğerleri, yarasa koronavirüsü SHC014'ün farelere uyarlanmış SARS-CoV omurgasında ifade edilebildiği kimerik bir virüsü çıkarmak ve tanımlamak için SARS-CoV'nin ters genetik sistemini kullandılar. ani. Sonuçlar, yeni koronavirüsün, insan solunum yolunun birincil hücrelerinde etkili bir şekilde çoğalmak ve in vitro SARS ile enfeksiyon elde etmek için SARS-anjiyotensin dönüştürücü enzim II'nin (ACE2) insan hücre reseptörünün çok sayıda homolog genini kullanabileceğini göstermektedir. Cinsiyetin aynı etkisi.
Ek olarak, in vivo deneyler, kimerik virüsün farelerin akciğerlerinde kopyalandıktan sonra belirgin semptomlara neden olabileceğini göstermiştir. Değerlendirmeler, mevcut SARS tabanlı immünoterapi ve önleme modellerinin etkili olmadığını göstermektedir; ne monoklonal antikorlar ne de aşı yöntemleri, immün CoVs enfeksiyonunu nötralize etmek için bu yeni spike proteinini kullanmamıştır.
Bu bulgulara dayanarak, yukarıda bahsedilen bilim adamları nihayet bulaşıcı bir tam uzunlukta SHC014 rekombinant virüsü sentezlemeyi başardılar ve virüsün in vitro ve in vivo güçlü replikasyon yeteneğini doğruladılar. Araştırma sonuçları, bu virüsün SARS-CoV (SARS koronavirüs) bulaşma riskini tamamen yeniden üretebileceğini gösteriyor.
Nature's makalesinin üç örneğinin kanıtladığı yeni taç virüsün bulaşma ilkesi, Wuhan salgınına oldukça benzer.
Aşağıdakiler, yukarıda bahsedilen 2015 "Nature" makalesinin ana analiz içeriğini çeviren ve sıralayan Titanium Medianın editörlerinden alınmıştır. İletim ilkesi gerçekten bu Wuhan yeni koroner pnömonisine benzer ve birçok sonuç da benzerdir. Örneğin, patojenite Sars koronavirüsünden daha iyi değildir. İyileştirme, insandan insana bulaşma olası riski büyüktür (oldukça bulaşıcıdır) ve yaşlı hayvanlar (deneyler çoğunlukla hayvanlar üzerinde yapılır) daha hassastır.
Yüksek derecede patojenik koronavirüs SARS koronavirüsünün ortaya çıkışı, şiddetli solunum yolu hastalıklarının türler arası bulaşmasında yeni bir çağın habercisidir. Küreselleşme, virüsün hızlı yayılmasının temelini oluşturdu ve küresel ekonomi üzerinde çok büyük bir etkiye sahip.
SARS dünyayı taradıktan sonra, influenza A alt tipi virüsler H5N1, H1N1 ve H7N9 ve MERS koronavirüs (Orta Doğu Solunum Sendromu) ortaya çıkmaya başladı ve ayrıca insanlara hayvanlar yoluyla bulaşarak ölümün gölgesini ve yerel nüfusa ekonomik kayıp getirebilir. .
Halk sağlığı önlemleri SARS koronavirüs salgınını kontrol etmesine rağmen, Metagenomik araştırmalar, son zamanlarda Çin'deki at nalı yarasaları arasında yaygın olan SARS benzeri koronavirüslerin virüs dizilerini belirledi ve bu yarasa kaynaklı virüslerin gelecekte daha fazla tehdit oluşturabileceğini buldu.
Bununla birlikte, virüs dizisinin getirdiği veriler, gelecekte benzer salgın virüslerin tanımlanması ve önlenmesi için yalnızca çok sınırlı bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, yarasaların taşıdığı koronavirüsün neden olduğu salgın bulaşma olasılığını (yani insanlara bulaşma olasılığını) analiz etmek için, insan ve hayvan bulaşmasına neden olabilen Çin at nalı yarasalarının taşıdığı RsSHC014 koronavirüs dizisinin koronavirüs delici proteinini çıkardık. Farelere uyarlanmış SARS koronavirüs omurgası kullanılarak bir kimerik virüs geliştirildi.
Yetiştirilen hibrit virüs, delici proteinin, doğal adaptif mutasyon olmaksızın insanları enfekte etme yeteneğini değerlendirmemize olanak tanır. Bu yöntemle, SHC014 koronavirüsünün canlı bir durumda neden olduğu insan hava yolu hücrelerinin enfeksiyon özelliklerini analiz ettik ve mevcut bağışıklık ve tedavi yöntemlerinin SHC014 koronavirüs üzerindeki etkisini test ettik. Bu araştırma yöntemi, metagenomik verileri yorumlayabilir ve gelecekte ortaya çıkabilecek virüslerin önlenmesine yardımcı olabilir ve gelecekteki salgınlara hazırlıklı değildir.
SHC014 ve ilgili RsWIV1 koronavirüs dizileri, bu tip koronavirüsün SARS koronavirüsünün yakın bir akrabası olduğunu göstermektedir (Şekil 1a, b). Bununla birlikte, SHC014 ve SARS koronavirüs arasında insan 14 kalıntılarını ve SARS koronavirüs reseptörünü bağlamada farklılıklar vardır. Reseptör, konakçı aralığını belirleyen 5 kalıntı içerir: Y442, L472, N479, T487 ve Y491. WIV1'de kalıntıların üçü Urbani SARS koronavirüsten farklıdır. Başlangıçta beklendiği gibi ACE2'ye bağlanmayı değiştirmeyeceklerdir.
Bu durum, iki sahte tipleme deneyiyle doğrulandı. Deneylerden biri, lentivirüs cinsi WIV1'in, anjiyotensin dönüştürücü enzim II'yi (AC2) serbest bırakmak için proteini hücrelere delme yeteneğini test etti. Diğer deney, WIV1 koronavirüsü kopyalamak için bir test tüpü deneyidir (ref. 1). SHC014'te, ACE2 ile etkileşime giren 14 kalıntı vardır, bunlardan 7'si SARS koronavirüsten farklıdır Bu, konakçı aralığını belirlemede anahtar rol oynayan 5 kalıntıyı da içerir.
Bu değişiklikler ve SHC014 delici proteini hücreye salan lentiviral psödotip deneyinin yanı sıra, SHC014 delici proteinin insan ACE2'sine bağlanamadığını gösterir.
Bununla birlikte, bazı çalışmalar, diğer ilgili SARS koronavirüs suşlarının benzer değişikliklere sahip olduğunu bulmuştur, bu da daha iyi kararlar vermek için daha fazla fonksiyonel test yapmamız gerektiği anlamına gelir. Bu nedenle, farelerin patogenezini ve aşı araştırmalarını incelemek için güçlü replikasyon işlevi ve gerçek yanıtı olan farelerin SARS koronavirüs omurgasına dayalı olarak SHC014 delici proteini (kimerik koronavirüs bundan sonra toplu olarak SHC014-MA15 olarak anılacaktır) sentezledik. . Mevcut moleküler modelleme ve psödotipleme deneyleri tarafından yapılan tahminlerin aksine, SHC014-MA15, aktiviteyi sürdürdü ve Vero hücrelerinde yüksek titrelere kopyalandı.
SARS virüsüne benzer şekilde, SHC014-MA15 ayrıca hücreye girmek için işlevsel bir ACE2 molekülüne ihtiyaç duyar ve insanların, misk kedilerinin ve yarasaların ortolog ACE2'sini kullanabilir. SHC014'ün insan hava yolundaki proteini delme yeteneğini test etmek için, insan epitel hava yolu hücre hattı Calu-32B4'ün enfeksiyona karşı duyarlılığını inceledik ve SHC014-MA15'in Urbani SARS virüsü ile karşılaştırılabilir güçlü bir replikasyon yeteneğine sahip olduğunu bulduk.
Ek olarak, insan birincil hava yolu epitel (HAR) kültürleri enfekte edildi ve her iki virüs de güçlü replikasyon yetenekleri gösterdi. Özetle, bu veriler SHC014 ile virüsün insan hava yolu hücrelerini enfekte etme kabiliyetini doğruluyor ve SHC014 koronavirüsün potansiyel bir türler arası bulaşma tehdidine sahip olduğunu gösteriyor.
Şekil | SARS benzeri koronavirüs, insan hava yolu hücrelerinde çoğalır ve in vivo patogenez üretir
SHC014 sekonder proteininin in vivo enfeksiyona aracılık etmedeki rolünü değerlendirmek için, 10 haftalık BALB / c farelerini enfekte etmek için 104 SARS-MA15 veya SHC014-MA15 plak oluşturma birimi (pfu) kullandık (Şekil 1e-h) .
SARS-MA15 ile enfekte olan beyaz fareler, enfeksiyondan sonraki 4. günde hızlı kilo kaybı ve ölüm gösterdi (d.p.i.); SHC014-MA15 ile enfekte olan farelerde önemli bir kilo kaybı (% 10) vardı, ancak ölüm olmadı (Şekil 1e).
Virüs replikasyonunun tespiti, SARS-MA15 veya SHC014-MA15 ile enfekte edilmiş farelerin akciğerlerindeki virüs titrelerinin hemen hemen aynı olduğunu gösterdi (Şekil 1f). SARS-MA15 ile enfekte edilmiş farelerin akciğerlerinin periferal bronşiyolleri ve akciğer parankimi (Şekil 1g), güçlü bir boyama derecesi (Şekil 1g) gösterirken, SHC014-MA15 ile enfekte edilmiş farelerin akciğer antijen boyaması daha zayıf olmuştur (Şekil 1g). 1h); Aksine, yumuşak dokuda veya genel doku skorlarında antijen boyama kusurları bulunmadı, bu da akciğer dokularının farklı SHC014-MA15 enfeksiyonlarına sahip olduğu anlamına geliyor (Ek Tablo 2).
SARS-MA15 ile enfekte olmuş hayvanlar hızla kilo verdiler ve enfeksiyondan öldüler (Ek Şekil 3a, b). SHC014-MA15 ile enfeksiyon, hayvan ağırlığında önemli bir azalmaya neden olabilir, ancak ölüm oranı son derece düşüktür. Genç farelerde gözlemlenen histoloji ve antijen boyama modelleri, yaşlı farelerde de gözlemlenebilir (Ek Tablo 3). Deney için Ace2 fareleri kullandık ve SHC014-MA15'in başka bir enfeksiyon alıcısına yayılma olasılığını dışladık.
Bu durumda fareler, SHC014-MA15 (Ek Şekil 4 a, b ve Ek Tablo 2) ile enfekte edildikten sonra kilo vermedi veya antijenleri boyadı. Yukarıdaki veriler, SHC014 sivri uçlu virüsün, CoV virüsü omurgası koşulu altında farelerde kilo kaybına neden olabileceğini göstermektedir.
Ebola monoklonal antikor tedavisinin (ZMApp 10 gibi) klinik etkinliği göz önüne alındığında, daha sonra SARS-CoV monoklonal antikorunun SHC014-MA15 enfeksiyonuna karşı etkinliğini belirlemeye çalıştık. Spike proteininin SARS koronavirüse karşı kapsamlı nötralizasyonu daha önce bildirilmiştir ve muhtemelen insan monoklonal antikorları olan bir immünolojik reaktiftir.
Bu antikorların virüs replikasyonu üzerindeki etkisini kontrol ettik (virüs replikasyonunun inhibisyon yüzdesi olarak ifade edilir) ve yabani tip SARS-CoV Urbani'nin nispeten düşük antikor konsantrasyonlarında dört antikorun tümü tarafından ve SHC014-MA15 ile nötralize edildiğini bulduk. Etki farklı. Faj gösterimi ile üretilen ve mutantlardan kaçan antikorlar, yalnızca SHC014-MA15'in replikasyonunu inhibe edebilir (Şekil 2a). Benzer şekilde, SARS-CoV ile enfekte hastaların bellek B hücrelerinden türetilen 230.15 ve 227.14 antikorları da SHC014-MA15'in kopyalanmasını engelleyemedi (Şekil 2b, c).
Üç antikorun tümü için, SARS ve SHC014 spike amino asit dizileri arasındaki fark, SARS-CoV kaçış mutantında (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q / E) bulunan doğrudan veya bitişik kalıntı değişikliklerine karşılık gelir; Antikorun silinmesi, SHC014'ün nötrleştirme aktivitesine yöneliktir.
Son olarak, monoklonal antikor 109.8, SHC014-MA15'in% 50 nötralizasyonunu sağlamayı başardı, ancak yalnızca yüksek konsantrasyonlarda (10g / ml) (Şekil 2d). Özet olarak sonuçlar, SARS-CoV'ye karşı geniş ölçüde nötralize edici antikorların, ortaya çıkan SARS benzeri CoV suşlarına (SHC014 gibi) karşı yalnızca marjinal etkinliğe sahip olabileceğini göstermektedir.
Şekil SARS benzeri CoV'ye karşı SARS-CoV monoklonal antikorunun etkinliğinin çizgi şeması
Mevcut aşıların SHC014-MA15 enfeksiyonuna karşı etkinliğini değerlendirmek için, araştırmacılar yaşlı fareleri çift inaktive edilmiş tam SARS-CoV (DIV) aşısı ile aşıladılar. Önceki çalışmalar, bu aşılama yönteminin genç fareleri homolog virüslerden etkisiz hale getirebileceğini ve koruyabildiğini göstermiştir; ancak aşı, gelişmiş immünopatolojinin de gözlendiği yaşlı hayvanları korumada başarısız olmuştur, bu da aşılama nedeniyle olduğunu göstermektedir. , Hayvan yaralandı. Burada, DIV'nin kilo kaybı veya virüs titresi açısından saldırılara karşı SHC014-MA15 koruması sağlayamadığını bulduk (Şekil 5a, b). Diğer heterojen CoV'lerin önceki raporlarıyla tutarlı. Ek olarak, DIV ile aşılanmış yaşlı farelerden alınan serum da SHC014-MA15'i nötralize edemedi (Şekil 5c).
DIV aşılamasının güçlü bir immünopatoloji ve eozinofili ile sonuçlandığını belirtmek gerekir. Bu sonuçlar DIV aşısının SHC014 enfeksiyonunu önleyemediğini ve aşılanmış yaşlı grupta hastalığı artırabileceğini doğrulamaktadır.
DIV aşılama ile karşılaştırıldığında, canlı zayıflatılmış aşı olarak SHC014-MA15'in kullanılması SARS-CoV tehdidine karşı potansiyel çapraz koruma gösterir. Makalede yer alan araştırmacı, genç fareleri enfekte etmek için 104 pfu SHC014-MA15 kullandığını ve 28 gün boyunca gözlemlediğini belirtti. Daha sonra 29. günde farelere SARS-MA15 ile meydan okudular.
SHC014-MA15 enfeksiyonundan 28 gün sonra üretilen antiserum çok az SARS-CoV nötralizasyonuna sahip olmasına rağmen, önceden yüksek dozlarda SHC014-MA15 ile enfekte olan fareler, ölümcül SARS-MA15 tehdidine karşı savunma yapabilir.
İkincil antijen desteğinin yokluğunda, 28 dpi'de antikor titrelerinin beklenen tepe değeri, SARS-CoV'ye karşı korumanın zamanla azalacağı anlamına gelir. Kilo kaybı ve virüs replikasyonu açısından, yaşlanan BALb / c farelerinde benzer sonuçlar gözlendi, bu da öldürücü bir SARS-CoV dozunun koruyucu bir etkiye sahip olduğunu gösterir. Bununla birlikte, bazı yaşlı hayvanlarda, enfektif SHC014-MA15 dozu 104 pfu idi ve bu da kilo kaybı ve ölümle sonuçlandı. > % 10.
Araştırmacılar, daha düşük dozda SHC014-MA15 (100 pfu) ile aşılamanın kilo kaybına neden olmadığını, ancak yaşlı hayvanları SARS-MA15'in ölümcül dozundan korumadığını buldu. Kısaca, makaleye göre veriler SHC014-MA15 tehdidinin konservatif bir epitop yoluyla SARS-CoV'ye karşı çapraz koruma sağlayabileceğini, ancak gerekli dozun patogenezi indükleyebileceğini ve zayıflatılmış bir aşı olarak kullanılamayacağını göstermektedir.
SHC014 dikeninin insan hücre enfeksiyonuna aracılık etme ve farelerde hastalığa neden olma kabiliyetine sahip olduğunu doğruladıktan sonra, SARS-CoV için kullanılan yönteme dayalı olarak tam uzunlukta bir SHC014-CoV bulaşıcı klonu sentezledik. Vero hücrelerindeki replikasyon, SHC014-CoV'nin SARS-CoV'ye göre kusurlu olmadığını gösterdi; bununla birlikte, SHC014-CoV, enfeksiyondan 24 ve 48 saat sonra birincil HAE kültürlerinde önemli ölçüde zayıfladı (P
SARS-CoV Urbani ile karşılaştırıldığında, farelerin in vivo enfeksiyonu önemli kilo kaybı göstermedi. Bununla birlikte, tam uzunlukta SHC014-CoV ile enfekte olan akciğerler, azalmış virüs replikasyonunu gösterdi. Özet olarak, bu sonuçlar, tam uzunluktaki SHC014-CoV'nin yaşayabilirliğini doğrulamaktadır, ancak replikasyonunun insan solunum hücrelerinde ve farelerde dolaşan SARS-CoV replikasyonu ile tutarlı olması gerektiğini ve daha fazla adaptasyon gerektiğini göstermektedir.
Şekil SHC014-CoV, insan solunum yolunda kopyalanır, ancak salgın SARS-CoV'nin virülansından yoksundur.
SARS koronavirüs salgını sırasında insanlar, palmaceae ve insan koronavirüsleri arasındaki bağı hızla keşfettiler. Bu bulgudan yola çıkarak, farklı bakış açılarının iki paradigması vardır. Bunlar arasında ilk görüş, salgının bir yarasa virüsünden kaynaklandığı, çukura sıçradığı ve misk Ace2'ye bağlanmayı iyileştirmek için reseptör bağlanma alanında (RBD) değişiklikler getirdiği ve daha sonra canlı hayvan pazarında ortaya çıktığıdır. İnsanlarla temas halinde, insanlara misk suşu bulaşmıştı ve bu misk suşu, popüler bir suş olmaya uygundu.
Bununla birlikte, geliştirme döngüsü ve veri analizine göre, erken insan SARS suşları ile yarasa suşları arasındaki ilişki, misk suşlarına göre daha yakın görünmektedir. Bu nedenle, ikinci görüş, yarasaların doğrudan bulaşmasının SARS-CoV'nin ortaya çıkmasına yol açarken, avuç içlerinin ikincil ve kalıcı konaklar olduğudur. Her iki paradigma için de, tepe noktasının ikincil konakta adapte edilmesi gerektiğine inanılmaktadır, çünkü çoğu mutasyonun RBD içinde meydana gelmesi ve böylece enfeksiyonun iyileştirilmesine yardımcı olması beklenmektedir. Her iki teori de, yarasa koronavirüs kütüphanesinin sınırlı olduğunu ve konakçı menzilli mutasyonların hem rastgele hem de nadir olduğunu ve dolayısıyla gelecekte acil durum olasılığını azalttığını ima ediyor.
Şekil Koronavirüsün ortaya çıkışına (yayılmasına) örnek
Nature gazetesi, bu yeni araştırmanın yukarıda bahsedilen iddiaları ve paradigmaları bozmadığını belirtmesine rağmen, üçüncü bir paradigma önermiştir. Bu makalenin yazar ekibi, yarasa CoV virüs hücrelerinin, "dengeli" bir başak proteinini korumak için insanları mutasyon olmaksızın enfekte edebileceğine inanmaktadır. Bu hipotez, SARS-CoV omurgasındaki SHC014 artışını içeren kimerik virüsün, insan hava yolu kültürlerinde ve RBD adaptasyonu olmayan farelerde güçlü enfeksiyona neden olma kabiliyetiyle açıklanabilir.
Daha önce tanımlanan patojenik koronavirüslerin ana zincirinin gözlemiyle birleştiğinde, yukarıda bahsedilen makalelerin sonuçları, SARS benzeri suşlar için acil olarak ihtiyaç duyulan hammaddelerin şu anda hayvan rezervuarlarında dolaştığını göstermektedir. Tam uzunluktaki SHC014-CoV, insan hastalıklarına aracılık etmek için ek omurga uyarlanabilirliği gerektirse de, CoV ailesindeki yüksek frekanslı rekombinasyon olaylarının, gelecekte ortaya çıkma olasılığını ve daha fazla hazırlık ihtiyacını vurgulamak için belgelendiğini belirtmek gerekir.
Şimdiye kadar, hayvan popülasyonlarının genomik taraması esas olarak salgın ortamlarındaki yeni virüsleri tanımlamak için kullanıldı. Buradaki yöntem, virüs ortaya çıkması ve tedavi etkinliği sorunlarını incelemek için bu veri setlerini genişletir. SHC014 sivri uçlu virüsün, insan hastalığının mevcut en iyi modeli olan birincil insan hava yolu kültürlerinde çoğalma kabiliyeti nedeniyle potansiyel bir tehdit olduğuna inanıyoruz. Ek olarak, farelerde gözlemlenen patogenez, SHC014 içeren virüslerin, RBD adaptasyonu olmaksızın memeli modellerinde hastalığa neden olabileceğini gösterir.
SARS-CoV Urbani ile karşılaştırıldığında, SARS-MA15 ile karşılaştırıldığında, akciğerdeki anizotropinin ve SARS-CoV Urbani'ye göre HAE kültürlerinde tam uzunluktaki SHC014-CoV'nin zayıflamasının, ACE2'nin bağlı olmadığını öne sürdüğünü belirtmek gerekir. Sivri uçlar, reseptör biyoyararlanımı veya antagonistik konakçı immün tepkisi gibi faktörlerin bazıları ortaya çıkmaya katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, bu bulguları insan patojenik potansiyeline dönüştürmek için insan olmayan primatlarda daha fazla test yapılması gerekmektedir. Daha da önemlisi, mevcut tedavilerin başarısızlığı, tedavilerin daha fazla araştırılması ve geliştirilmesi için temel bir ihtiyacı tanımlar. Bu bilgi ile, SHC014 gibi gruba özgü CoV'nin ortaya çıkmasını önlemek için izleme prosedürleri, teşhis reaktifleri ve etkili tedaviler üretilebilir ve benzer heterojen kitaplıkları koruyan diğer CoV dallarına uygulanabilir.
Önceki modellere dayanarak, araştırmacılar yeni koronavirüsün patojeniteyi artırmadığına inanıyor. Yazar, kimerik virüslerin (SHC014-MA15 gibi) patojeniteyi artırmasının beklenmediğini belirtti. SHC014-MA15'in ebeveyn farelerine uyarlanmış SARS-CoV'ye göre zayıflatılmasına rağmen, benzer çalışmalar MA15 omurgasındaki vahşi tip Urbani dikenli CoV'nin patojenitesini incelemiş ve farelerde kilo kaybı olmadığını ve virüs replikasyonunun azaldığını göstermiştir. Bu nedenle, SHC014-MA15'in patogenezi, Urbani-MA15 CoV'nin zirvesine kıyasla iyileştirilmiştir.
Bu bulgulara dayanarak, bilimsel inceleme ekibi, benzer çalışmaların, riske atılamayan dolaşımdaki suşlara dayanan kimerik virüslerin yapımına dayandığına inanabilir, çünkü memeli modellerindeki patojenite artışı göz ardı edilemez. Fareye uyarlanmış suşlar üzerindeki kısıtlamalar ve monoklonal antikorlar geliştirmek için kaçış mutantlarının kullanımı ile birleştiğinde, CoV'nin ortaya çıkışı ve terapötik etkinliği üzerine araştırmalar ciddi şekilde sınırlı olabilir. Bu veriler ve kısıtlamalar birlikte, yeni koronavirüs araştırması için bir kavşak noktasını temsil ediyor. İleriye dönük politikalar oluştururken, gelecekteki salgınlara hazırlık yapma ve bunları hafifletme potansiyelini daha tehlikeli patojenler oluşturma riskine karşı tartmalıyız.
Genel olarak, araştırmacılar, metagenomik verileri kullanarak dolaşan yarasa SARS benzeri CoV SHC014'ün oluşturduğu potansiyel tehdidi belirlemek için deneyler ve analizler kullandılar. Kimerik SHC014 virüsünün insan hava yolu kültürlerinde replike olma, in vivo patogeneze neden olma ve mevcut tedavi yöntemlerinden kaçma kabiliyeti nedeniyle, SARS benzeri virüslerin dolaşımı için sürveyans ve iyileştirilmiş tedavi yöntemlerine ihtiyaç vardır. Yöntemimiz ayrıca virüslerin ortaya çıkışını tahmin etmek için metagenomik verilerini kullanabilir ve bu bilgiyi gelecekteki viral enfeksiyonların tedavisine hazırlanmak için kullanabilir.
Yeni koronavirüsü geliştirme ve üretme deneysel süreci
Aşağıda, Titanium Medianın yukarıdaki makaledeki bilim adamlarının yeni bir tür koronavirüs geliştirip ürettikleri deneysel sürecin düzenlenmesi ve harmanlanması yer almaktadır. Bu işleme " Virüs, hücre, in vitro enfeksiyon ve plak tahlil protokolü ".
Bilim adamları, ABD Ordusu Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü'nden, farelere uyarlanmış SARS-CoV (MA15) ve Vero E6 orta hücrelerinde kimerik SARS tipi CoV virüsü hücrelerinden vahşi tip SARS-CoV (Urbani) alacaklar. Bu hücrenin, Amerikalı virolog Dulbecco (Renato) tarafından geliştirilen geliştirilmiş bir Eagle besiyerinde yetiştirildiği bildirilmektedir.
Ek olarak, elde edilen viral hücre dokuları, daha önce insanlar ve misk kedileri olarak tanımlanan ACE2 ortologlarını (Baric Laboratories, kaynak bilinmiyor) ifade eden DBT hücreleri dahil olmak üzere önceki çalışmalardan elde edilen bilgilere dayanmaktadır. Enfekte dokularda, ACE2 dizisi yarasa DBT hücrelerinin yarasadan ekstraksiyonuna ve yeni virüs kültürlerinin oluşturulmasına dayanır.
Yazara göre, bu deneyin kendisi, HIV tabanlı bir sözde virüs deneyine benzeyen sözde tip bir deneysel süreçtir. Daha önce, inceleme için Wuhan Viroloji Enstitüsü tarafından sağlanan ACE2 tarafından doğrudan ifade edilen homolog türlerin HeLa hücreleri kullanıldı. HeLa hücreleri,% 10 FCS (Gibco, CA) ve MEM (Gibco, CA) ile desteklenen minimum temel ortamda büyütülür.Aşağıdaki şekil Vero E6, DBT ve Calu-3 ve 2B4 birincil insan solunum epitelinde çizilmiştir. Hücre büyüme eğrisi.
Deney, taklit akciğer, Kuzey Carolina Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulunun onayı altında satın alındı Bu akciğer canlı bir akciğer değil, HAE'de yetiştirilen bir insan akciğeridir. HAE kültürü, siliyer ve siliyer olmayan epitel hücreleri ve goblet hücrelerini içeren oldukça farklılaşmış bir insan hava yolu epitelini temsil eder Kültür, bu deneyde kullanılmadan önce birkaç hafta hava-sıvı arayüzünde büyütülmelidir.
Daha sonra hücreler, PBS çözeltisi ile yıkandı ve virüs ile aşılandı veya PBS çözeltisi içinde 37 ° C'de 40 dakika süreyle seyreltildi. Hücreleri 3 kez yıkayın ve "0" süresini belirtmek için taze ortam ekleyin. Belirtilen her zaman noktasında üç veya daha fazla biyolojik kopya numunesi toplandı ve tüm virüs kültürleri, biyogüvenlik seviyesi (BSL) seviye 3 olan bir laboratuarda gerçekleştirildi.
Personel ve çevre açısından, fazlalık biyolojik hücreler ilgili güvenlik dolaplarına yerleştirilir ve ısı dağıtımı için elektrikli fanlar kullanılır. Tüm personel sağlığı iyileştirilmiş özel koruyucu giysiler giyerler Deney sürecinin sağlığı için, ilgili bilimsel araştırmacılar nefes almak için 3M elektrikli solunum cihazları (Breathe Easy, 3M) kullanır ve kesinlikle çift eldiven giyerler, böylece deney güvenli koşullar altında gerçekleştirilebilir.
Sıra kümeleme ve yapı modelleme
Deneyde, temsili CoV S1 alanının tam uzunluktaki genom dizisini ve amino asit dizisini Genbank veya Pathosystems Kaynak Entegrasyon Merkezi'nden (PATRIC) indirin ve ClustalX ile karşılaştırın ve sistem analizi yoluyla 100 önyükleme yöntemi veya PhyML kullanın (Https://code.google.com/p/phyml/) paketi.
Aslında bu süreç esas olarak verileri karşılaştırmak, virüsün gelecekteki mutasyonunu kontrol etmek ve belirli bir veri modeli oluşturmak içindir.
Daha sonra, araştırmacılar PhyML yazılım paketini maksimum olabilirlik değerleri ağacı oluşturmak için kullanırlar. Ölçek çubuğu, nükleotid ikamelerini temsil eder. Yalnızca% 70'in üzerindeki düğümler için önyükleme desteğini işaretleyin. Ağaç, CoV'nin -CoV, -CoV ve -CoV olarak tanımlanan üç farklı filogenetik gruba ayrıldığını göstermektedir. -CoV için klasik alt grup kümeleri 2a, 2b, 2c ve 2d olarak etiketlenir ve -CoV için 1a ve 1b olarak etiketlenir. Kristal yapı 2AJF'ye (Protein Veritabanı) dayalı olarak ACE2 ile SARS RBD SHC014 ve Rs3367'nin bir homoloji modelini oluşturmak üzere yapısal bir model oluşturmak için Modeller'ı (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) kullanın. MacPyMol'de (sürüm 1.3) homoloji modellerini görselleştirin ve işleyin.
SARS benzeri kimerik virüsün yapımı
Daha önce belirtildiği gibi, hem vahşi tip hem de kimerik virüsler SARS-CoV Urbani'den veya karşılık gelen fareye uyarlanmış (SARS-CoV MA15) bulaşıcı klon (ic) virüs hücrelerinden türetilir. SHC014 spike sekansını içeren plazmidi ekstrakte ederek ve MA15 bulaşıcı klonun E ve F plazmidlerine bağlayarak. Klon tasarlandı ve Bio Basic'ten altı ardışık cDNA satın alındı ve benzersiz bir Sınıf II kısıtlama endonükleaz bölgesi (BglI) ile çevrili yayınlanmış sekans kullanıldı.
Daha sonra, araştırmacılar vahşi tip, kimerik SARS-CoV ve SHC014-CoV genom fragmanlarını içeren plazmidleri amplifiye, eksize, ligasyon ve saflaştırılmış plazmidler yaptılar. Daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi Vero E6 hücrelerine transfekte edilen tam uzunluktaki genomik RNA'yı sentezlemek için bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirildi. Transfekte edilmiş hücrelerin kültür ortamı hasat edildi ve sonraki deneyler için bir tohum bankası olarak kullanıldı. Bu çalışmalarda kullanılmadan önce, kimerik ve tam uzunluktaki virüsler dizi analizi ile doğrulanmıştır. Kimerik mutantın sentetik yapısı ve tam uzunlukta SHC014-CoV, bu yeni SARS benzeri kimerik virüs standardı, Kuzey Carolina Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi ve İkili Kullanım Araştırma Komitesi tarafından onaylanmalıdır.
Farelerde enfeksiyon
Aslında bu deney, insan vücuduna dayalı direnç ve virüs oluşum aktivitelerini anlamalı ve çoklu veriye sahip farelerde enfeksiyonun bir veri analizini oluşturmalıdır.
Gazeteye göre Harlan Laboratories'den dişi, 10 haftalık ve 12 aylık BALb / c albino laboratuvar fareleri sipariş etti. Hayvanları BSL3 laboratuvarına getirin ve enfeksiyondan önce 1 hafta boyunca alışmalarına izin verin. Enfeksiyon ve canlı zayıflatılmış aşılama için farelere ketamin ve ksilazin karışımı ile anestezi uygulanacak ve her seferinde nazal enfeksiyon sırasında intranazal enfeksiyon için 50l fosfat tamponlu salin (PBS) veya seyreltilmiş virüs kullanılacaktır. Nokta, üç veya dört fareden her biri, enfeksiyon grubunun her dozu koşullara göre ölçülür. Araştırmacılar, tek tek fareler için, tam dozu teneffüs etmeme, burun köpürmesi veya oral enfeksiyonun neden olduğu enfeksiyon dahil olmak üzere, kendi takdirine bağlı olarak fare verilerini hariç tutup tutmayacağına karar verebilir.
Enfeksiyondan sonra, hiçbir hayvan deneyinde körleme yöntemi kullanılmadı ve hayvanlar rastgele seçilmedi. Fareleri aşılayın ve genç ve yaşlı fareleri, şap veya simüle edilmiş PBS içeren 20 l 0.2 g çift etkisizleştirilmiş SARS-CoV aşısıyla aşılayın; daha sonra, 22 gün sonra, farelerin bağışıklık yapısı aynı protokolle güçlendirildi. Tüm gruplar için, deneysel protokole göre, hayvanlar deney sırasında klinik hastalık belirtileri (kambur sırt, gevşek kürk ve azalmış aktivite) açısından günlük olarak izlendi. İlk 7 gün boyunca, her gün kilo kaybını izleyin ve hayvan ilk ağırlığına dönene veya arka arkaya 3 gün kilo artışı gösterene kadar ağırlık izlemeye devam edin. Başlangıç vücut ağırlıklarının% 20'sinden fazlasını kaybeden tüm fareler,% 20 eşiğinin altında kaldıkları sürece günde birkaç kez beslendi ve izlendi.
Deneysel protokole göre, vücut ağırlığı ilk vücut ağırlığının% 30'unu aşan fareler hemen öldürüldü. Araştırmacılara göre, ölmekte olduğu düşünülen veya iyileşme olasılığı düşük olan farelere izofluran doz aşımı ile ötenazi uygulanacak ve servikal dislokasyonla ölüm doğrulanacaktır.Bu tedavi UNC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ni (IACUC ) Onaylanmış plan.
Histolojik analiz
Deneyden sonra, sol akciğer çıkarıldı ve 1 hafta süreyle şişirme olmadan% 10 formalin tamponuna (Fisher) daldırıldı. Doku parafine gömüldü ve 5 m'lik kesitler UNC Lineberger Kapsamlı Kanser Merkezi Histopatoloji Çekirdek Tesisi'nde hazırlandı. Antijen boyama derecesini belirlemek için, ticari olarak temin edilebilen bir poliklonal SARS-CoV anti-nükleokapsid antikoru (Imgenex), virüs antijeni için kesiti boyamak için kullanıldı ve hava yolu ve parankim, Olympus DP71'li bir kamera kullanılarak kör bir şekilde boyandı. Olympus BX41 mikroskobu görüntüyü yakalar.
Virüs nötralizasyonunun belirlenmesi ve istatistiksel analiz
Bu bölümde, SARS-CoV'ye karşı önceden karakterize edilmiş antikorlarla plak azaltma nötralizasyon titresi deneyi gerçekleştirildi. Kısaca, antikor veya serumu nötralize etmek, iki kez seyreltmek ve 37 ° C'de 1 saat boyunca farklı bulaşıcı klonların 100 pfu SARS-CoV suşları ile inkübe etmektir. Daha sonra virüs ve antikoru 5 x 105 kuyucuklu Vero E6 hücresi ile başka bir kuyucuk plakasına ekleyin ve birkaç kez (n2) tekrarlayın.
37 ° C'de 1 saat inkübe edildikten sonra, araştırmacıların ortama 3 ml% 0.8 agaroz yaymaları gerekir. Plaka 37 ° C'de 2 gün inkübe edildikten sonra, 3 saat boyunca nötr kırmızı ile boyanır ve plaklar sayılır. Plak azaltma yüzdesini (1 - ((antikora sahip plak sayısı / antikorsuz plak sayısı)) × 100 olarak hesaplayın.
Deneyden sonra istatistiksel analiz yapıldı ve tüm deneyler iki deneysel grupla (iki tür virüs veya aşılanmış ve aşılanmamış kohortlar) karşılaştırıldı. Bu nedenle, virüslerdeki önemli farklılıklar, çeşitli zaman noktalarında test edilerek belirlenir. Nihai veriler normal olarak dağıtılır ve benzer varyanslar her karşılaştırma grubuna yerleştirilir. (Bu makale ilk olarak Titanium Media App yayınlandı)
Orijinal kağıt adresi:
https://www.nature.com/articles/nm.3985#auth-14
Referans kaynağı:
https://microbiology.utmb.edu/faculty/vineet-d-menachery-phd
https://www.the-scientist.com/news-opinion/lab-made-coronavirus-triggers-debate-34502
https://www.nature.com/articles/d41586-020-00262-7
